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液相色譜儀原理

更新時間:2016-10-22點擊次數(shù):3393

液相色譜儀原理
【儀器原理】液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎上,引用了氣相色譜的理論,在技術上,流動相改為高壓輸送(zui高輸送壓力可達4.9′107Pa);色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成,從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜(每米塔板數(shù)可達幾萬或幾十萬);同時柱后連有高靈敏度的檢測器,可對流出物進行
連續(xù)檢測。
【液相色譜儀特點】1.高壓:液相色譜法以液體為流動相(稱為載液),液體流經(jīng)色譜柱,受到阻力較大,為了迅速地通過色譜柱,必須對載液施加高壓。一般可達150~350*105Pa 。
2.高速:流動相在柱內(nèi)的流速較經(jīng)典色譜快得多,一般可達1~10ml/min。液相色譜法所需的分析時間較之經(jīng)典液相色譜法少得多,一般少于1h 。
3.:近年來研究出許多新型固定相,使分離效率大大提高。
4.高靈敏度:液相色譜已廣泛采用高靈敏度的檢測器,進一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測器靈敏度可達10-11g。另外,用樣量小,一般幾個微升。
5.適應范圍寬:氣相色譜法與液相色譜法的比較:氣相色譜法雖具有分離能力好,靈敏度高,分析速度快,操作方便等優(yōu)點,但是受技術條件的限制,沸點太高的物質或熱穩(wěn)定性差的物質都難于應用氣相色譜法進行分析。而液相色譜法只要求試樣能制成溶液,而不需要汽化,因此不受試樣揮發(fā)性的限制。對于高沸點、熱穩(wěn)定性差、相對分子量大(大于400 以上)的有機物(這些物質幾乎占有機物總數(shù)的 75% ~ 80%)原則上都可應用液相色譜法來進行分離、分析。據(jù)統(tǒng)計,在已知化合物中,能用氣相色譜分析的約占20%,而能用液相色譜分析的約占70% ~80% 。
【液相色譜儀各個系統(tǒng)的組成和特點是什么?】
液相色譜儀主要有進樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),下面將分別敘述其各自的組成與特點。
1.進樣系統(tǒng)
一般采用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作,進樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復性是有益的。
2.輸液系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l.47~4.4×107Pa,流速可調且
穩(wěn)定,當高壓流動相通過層析柱時,可降低樣品在柱中的擴散效應,可加快其在柱中的移動速度,這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存器和梯度儀可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變,包括改變洗脫液的極性、離子強度、pH 值,或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(即使僅有一個基團的差別或是同分異構體)都能獲得有效分離。
3.分離系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長度為10~50cm(需要兩根連用時,可在二者之間加一連接管),內(nèi)徑為2 ~5mm ,由不銹鋼、厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成,柱內(nèi)裝有直徑為5~10μm粒度的固定相(由基質和固定液構成)。固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或硅膠構成,它們都有惰性、多孔性和比表面積大的特點,加之其表面經(jīng)過機械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣),或者用化學法偶聯(lián)各種基因(如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等)或配體的有機化合物。
因此,這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性。例如,在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素(PSA)后,就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。
另外,固定相基質粒小,柱床極易達到均勻、致密狀態(tài),極易降低渦流擴散效應。基質粒度小,微孔淺,樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析,基質粒度越小,塔板理論數(shù)N 就越大,這也進一步證明了基質粒度小,會提高分辨率的道理。
此外,液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調到60℃,通過改善傳質速度,縮短分析時間,就可增加層析柱的效率。
4.檢測系統(tǒng)
液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。
(1)紫外檢測器
該檢測器適用于對紫外光(或可見光)有吸收性能樣品的檢測。其特點是,使用面廣(如蛋白質、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用)、靈敏度高(檢測下限為10-10g/ml)、線性范圍寬、對溫度和流速變化不敏感、可檢測梯度溶液洗脫的樣品。
(2)示差折光檢測器
凡具有與流動相折光率不同的樣品組分,均可使用示差折光檢測器檢測。目前,糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統(tǒng)。這一系統(tǒng)通用性強、操作簡單,但靈敏度低(檢測下限為10-7g/ml),流動相的變化會引起折光率的變化,因此,它既不適用于痕量分析,也不適用于梯度洗脫樣品的檢測。
(3)熒光檢測器
凡具有熒光的物質,在一定條件下,其發(fā)射光的熒光強度與物質的濃度成正比。因此,這一檢測器只適用于具有熒光的有機化合物(如多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質等)的測定,其靈敏度很高(檢測下限為10-12~10-14g/ml),痕量分析和梯度洗脫樣品的檢測均可采用。
(5)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
該系統(tǒng)可對測試數(shù)據(jù)進行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作,使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。
上述介紹的內(nèi)容是通用儀器的原理,各液相色譜儀的具體操作要求,需使用者仔細閱讀儀器說明書。

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